Terapia recombinante con Fsh y Lh para la inducción del desove de teleósteos detenidos previtelogénicos y espermatogénicos tempranos, el salmonete de cabeza plana (Mugil cephalus)

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 6563 (2022) Citar este artículo

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Con la expansión y diversificación de la acuicultura global, continúan los esfuerzos por desarrollar nuevas biotecnologías para la reproducción asistida en especies que presentan disfunciones reproductivas. Los machos de salmonete de cabeza plana (Mugil cephalus) mantenidos en condiciones intensivas en la región mediterránea no producen semen fluido y la mayoría de las hembras se detienen en la previtelogénesis. Las inyecciones semanales de hormona estimulante del folículo recombinante (rFsh) y hormona luteinizante (rLh) indujeron y completaron la vitelogénesis en las mujeres tratadas (n = 21), y los hombres tratados produjeron esperma fluido (n = 9). La aplicación de una dosis de cebado de 30 µg kg-1 rLh y una dosis de resolución de 40 mg kg-1 de progesterona, o dosis de cebado y resolución de 30 µg kg-1 rLh, dieron como resultado la inducción de la maduración, la ovulación y los desoves espontáneos con un éxito de desove del 85% (8 de 9 hembras) y del 100% (n=6), respectivamente. Los huevos colectados tuvieron 63 ± 21% de fertilización con desarrollo embrionario y 58 ± 23% de eclosión. En comparación, los individuos de control no mostraron avances en el desarrollo gonadal y no produjeron esperma fluido. Los resultados actuales confirman la posibilidad de controlar la ovogénesis desde la previtelogénesis hasta la finalización de la maduración y el desove en tanques fertilizados utilizando exclusivamente rFsh y rLh en una especie teleósteos.

La acuicultura intensiva está buscando formas de mejorar el control reproductivo, especialmente en especies reproductivamente disfuncionales, para asegurar el suministro de alevines para la producción comercial a gran escala. El desarrollo de protocolos de cultivo no sólo garantizará un suministro constante y sostenible para las operaciones de engorde, sino que también permitirá mejoras genéticas mediante la reproducción selectiva. El éxito de los protocolos de cultivo aliviará a su vez la presión pesquera sobre las poblaciones de poblaciones naturales que en muchos casos están comprometidas. Una parte esencial para proporcionar un suministro confiable de juveniles es controlar la reproducción de los peces adultos mantenidos en cautiverio. Sin embargo, algunas especies no completan su reproducción en cautiverio y se han empleado terapias hormonales exógenas para desarrollar la producción acuícola.

Las dos etapas reproductivas, la gametogénesis (oogénesis y espermatogénesis) y la maduración (maduración de ovocitos y espermiación) están controladas por diferentes hormonas reproductivas producidas en la hipófisis y las gónadas, es decir, hormonas gonadotropinas (Gths) y esteroides1. Las terapias hormonales basadas en hormonas liberadoras de gonadotropinas y agonistas de los receptores de la hormona luteinizante (gonadotropinas coriónicas humanas o extractos de hipófisis) se utilizan comúnmente para controlar la fase de maduración, mientras que el control hormonal de la gametogénesis rara vez se utiliza en la industria de la acuicultura2. El uso de hormonas gonadotropinas recombinantes (rGths) relativamente nuevas, las hormonas folículoestimulantes (rFsh) y luteinizantes (rLh) recombinantes, puede abrir nuevas estrategias en la acuicultura para tratar trastornos reproductivos y desarrollar programas de reproducción fuera de temporada3. Para ello se han desarrollado diferentes tratamientos in vivo, centrados principalmente en las etapas de maduración final y espermiación/ovulación mediante inyecciones simples o dobles de rGths4,5. Sin embargo, las especies de peces detenidas en las primeras etapas del ciclo reproductivo requieren control de la gametogénesis, con tratamientos a largo plazo de inyecciones repetidas que mantengan niveles plasmáticos elevados de Gths3 específicos. En el caso de los machos, se han descrito diferentes enfoques exitosos a largo plazo para la anguila europea inmadura (Anguilla anguilla)6 y el lenguado senegalés maduro (Solea senegalensis)7,8. En el caso de las hembras, ha sido difícil definir tratamientos similares a largo plazo para producir gametos viables a partir de hembras detenidas antes de la vitelogénesis. Se logró un avance significativo con el tratamiento a largo plazo de hembras previtelogénicas de salmonete gris (Mugil cephalus) con rFsh y rLh para completar con éxito la vitelogénesis9. Sin embargo, después de la inducción de la maduración con rLh y progesterona (P4), las hembras mantenidas con machos en espermiación no lograron desovar espontáneamente. Por lo tanto, los gametos fueron despojados y fertilizados artificialmente y se obtuvo un bajo porcentaje de fertilización (< 1%), lo que cuestionó la viabilidad del proceso con fines acuícolas. Sin embargo, a pesar de la baja fertilización, el estudio demostró la posibilidad de utilizar rFsh y rLh para inducir la ovogénesis a partir de la previtelogénesis para obtener huevos y larvas en condiciones intensivas y animó a seguir investigando para mejorar los resultados obtenidos.

El salmonete de cabeza plana tiene una distribución mundial en aguas tropicales, subtropicales y templadas10, tolerancia a amplios rangos de salinidades, excelente calidad de carne y altas tasas de crecimiento. Representa una especie importante y un candidato potencial en la diversificación de productos acuícolas principalmente en el área del Mediterráneo, el Sudeste Asiático, Taiwán, Japón y Hawaii11. En el Mediterráneo, el salmonete de cabeza plana desova de julio a octubre12, sin embargo, los criadores mantenidos en condiciones intensivas muestran disfunciones reproductivas; los machos rara vez producen lecha fluida13,14,15 y las hembras se encuentran detenidas en la previtelogénesis9 o en las primeras etapas de la vitelogénesis15.

El objetivo del presente estudio fue demostrar que el tratamiento a largo plazo con rGths, rFsh y rLh, puede inducir la gametogénesis en machos de lisa sin espermiación fluida y en hembras detenidas en etapas tempranas de la gametogénesis para obtener desove de huevos con buenas tasas de fertilización. que proporcionan larvas viables. Se probaron diferentes tratamientos basados ​​en rLh y P4 para inducir la maduración de ovocitos y el desove en hembras. Como paso final, para comprobar el desarrollo y crecimiento larvario, con los huevos obtenidos se realizó un ensayo preliminar de cría larvaria mediante la técnica del mesocosmos.

El estudio se realizó de acuerdo con la Directiva Europea 2010/63/UE, de 22 de septiembre, sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos; el Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero, sobre protección de animales utilizados para experimentación u otros fines científicos; la Ley catalana 5/1995, de 21 de junio, de protección de los animales utilizados para la experimentación u otros fines científicos y el Decreto catalán 214/1997, de 30 de julio, para la regulación de la utilización de animales para la experimentación u otros fines científicos. Los procedimientos utilizados fueron evaluados por el Comité de Ética y Experimentación con Animales (CEEA) del IRTA (Instituto de Investigación y Tecnología Agroalimentaria) y la Generalitat de Cataluña y los procedimientos autorizados con DNI V7MH4802M. Los autores cumplieron con las pautas ARRIVE.

Se formó un reproductor de mújol de cabeza plana con individuos obtenidos originalmente del río Ebro (España) o de una piscifactoría de estanque semiextensiva (Finca Veta La Palma, Isla Mayor, España) que habían permanecido entre 1,5 y 3,5 años en las instalaciones del IRTA. (Sant Carles de la Rápita, España). Se utilizaron treinta hembras con pesos que oscilaron entre 0,9 y 2,2 kg y longitud estándar (SL) de 37 a 53 cm, y 15 machos que oscilaron entre 0,7 y 1,3 kg y 34 a 43,5 cm LE. Todos los peces eran más grandes que el SL informado para la primera maduración en esta especie (27–35 cm para las hembras, 25–30 cm para los machos)12. Para identificar a los individuos, cada pez se marcó por vía intramuscular con una etiqueta de transpondedor integrado pasivo (PIT) (Trovan®, ZEUS Euroinversiones SL Madrid, España). El sexo de los individuos se determinó por la presencia o ausencia de ovocitos obtenidos mediante una ligera succión con un catéter plástico de 1,67 mm insertado a través de la abertura genital. Los peces se mantuvieron en tanques cubiertos de 10 m3 en un sistema de recirculación (IRTAmar®) alimentado con agua con una salinidad de 36 ‰ en condiciones naturales de luz y temperaturas invernales controladas (≥ 14 °C) durante el último año. Antes del estudio, realizado desde principios de agosto hasta principios de noviembre, los reproductores seleccionados se transfirieron a otro tanque de 10 m3, la temperatura del agua se controló a 23,1 ± 0,2 °C y el fotoperiodo fue ambiental (14L:10D–11L:13D). Los peces fueron alimentados los 7 días de la semana a razón del 1,5% de su peso corporal con una mezcla de dos dietas comerciales para peces marinos; 90% mezcla de Le-2 y Le-5 Europa RG (Skretting, España) y 10% Brood Feed Lean (Sparos, Portugal). Durante todos los procedimientos experimentales, para la administración de hormonas y el muestreo, los peces fueron anestesiados con 73 mg L-1 de MS-222. Cuando fue necesario para el estudio, los machos fueron sacrificados con una sobredosis de MS-222 (250 mg L-1) y la muerte se confirmó mediante un corte en las branquias para desangrar a los peces.

Las hembras fueron asignadas aleatoriamente a los grupos rGth y control, teniendo cuidado de tener una distribución similar de hembras en diferentes etapas iniciales de maduración en ambos grupos. El grupo control (n total = 9) se formó con 6 hembras en previtelogénesis (5 en crecimiento primario y 1 en etapa de alvéolo cortical) y 3 en vitelogénesis temprana. Un total de 21 mujeres fueron asignadas para recibir el tratamiento hormonal; 12 hembras se encontraban inicialmente en previtelogénesis (8 en crecimiento primario y 4 en etapa de alvéolo cortical) y 9 en vitelogénesis temprana. Aquellas hembras en vitelogénesis temprana tuvieron más tiempo en condiciones de cautiverio intensivo (> 2,25 años) aunque no todas las hembras que fueron mantenidas durante este tiempo habían iniciado la vitelogénesis.

Mugil cephalus rFsh y rLh recombinantes de cadena única producidos en células de ovario de hámster chino (CHO) se adquirieron de Rara Avis Biotec SL (Valencia, España). A Mugil cephalus rFsh se le suministró una concentración de 12 μg mL-1 y rLh con una concentración de 8 μg mL-1. Se siguió una metodología basada en el protocolo descrito por Ramos-Júdez et al.9. El patrón de aplicación de rFsh y rLh tuvo como objetivo imitar las variaciones fisiológicas de Fsh y Lh asociadas con el desarrollo reproductivo natural; Inicialmente solo se administró rFsh durante las primeras etapas de la gametogénesis y, posteriormente, una disminución de rFsh con un aumento de rLh para regular la gametogénesis tardía16. El protocolo se aplicó según el desarrollo ovárico (Fig. 1). Se administraron dosis semanales crecientes de 6, 9 y 12 µg kg-1 de rFsh por vía intramuscular para inducir la previtelogénesis (~ 100 µm de diámetro del ovocito) a la vitelogénesis (> 200 µm). Las dosis semanales se mantuvieron en 12 µg kg-1 durante la vitelogénesis. A medida que avanzaba la vitelogénesis y cuando el diámetro medio de los ovocitos más desarrollados era ≥ 300 µm, las hembras recibieron además una administración semanal de rLh en dosis crecientes. Inicialmente se administró una dosis de rLh de 2,5 µg kg-1 y se mantuvo hasta que las hembras entraron en vitelogénesis tardía (≥ 400 µm)17 y luego se aumentó a 4 y 6 µg kg-1. Con un diámetro de ovocito de ~ 500 µm, las dosis semanales de rFsh se redujeron a 4 µg kg-1 mientras que la rLh se aumentó a 9 µg kg-1. Se administró una combinación de 4 μg kg-1 de rFsh y 12 μg kg-1 de rLh por semana hasta que se completó el crecimiento vitelogénico. La finalización del crecimiento de los ovocitos se determinó cuando se consideró que los ovocitos se acercaban a la maduración; El examen microscópico mostró que los ovocitos más desarrollados se acercaban a los 600 µm de diámetro. Las nueve hembras del grupo de control también fueron manipuladas cada semana y se les inyectó solución salina (1 ml) un total de doce veces.

Representación esquemática del tratamiento con rFsh y rLh aplicado a hembras de mújol de cabeza plana (n = 21). El protocolo se aplicó según el desarrollo de las gónadas femeninas determinado mediante biopsias de ovario. Se aplicaron dosis semanales de 6, 9 y 12 µg kg-1 de rFsh para inducir la previtelogénesis (~ 100 µm de diámetro del ovocito) a la vitelogénesis (> 200 µm) y el crecimiento vitelogénico se mantuvo con una dosis de 12 µg kg-1 por semana. Cuando el diámetro medio de los ovocitos más grandes fue ≥ 300 µm, además de rFsh, se administró rLh en dosis crecientes. Inicialmente se administró una dosis de rLh de 2,5 µg kg-1 y se mantuvo hasta que las hembras presentaron ≥ 400 µm de ovocitos y se elevó a 4 y 6 µg kg-1. A ~ 500 µm de diámetro, las dosis semanales de rFsh se redujeron a 4 µg kg-1 mientras que la rLh se aumentó a 9 µg kg-1. Se administró una combinación de 4 μg kg-1 rFsh y 12 μg kg-1 rLh por semana hasta que se completó el crecimiento vitelogénico (~ 600 μm). Cada punto corresponde a una administración semanal. Este esquema representa el patrón de administración más largo de aquellas hembras que requirieron un total de trece semanas para completar el crecimiento vitelogénico.

La evaluación del desarrollo gonadal se realizó en semanas alternas mediante biopsias de ovario obtenidas mediante ligera succión a través de una cánula de plástico. Se examinaron muestras frescas de ovario bajo un microscopio (aumento × 40), para medir el diámetro medio de los ovocitos más avanzados (n = 20 por mujer) y se fijó una muestra para histología. Se obtuvieron muestras de sangre antes del tratamiento inicial (semana 0) y cuando se completó el crecimiento vitelogénico en el grupo tratado y al final del experimento en el grupo control.

Paralelamente, los machos fueron asignados aleatoriamente a los grupos rGth y control, teniendo cuidado de tener una distribución similar de machos en diferentes etapas iniciales de maduración en ambos grupos. El grupo control (n total = 6) se formó con 5 machos sin presencia de espermatozoides y 1 con presencia de espermatozoides (índice espermático 1, presencia de espermatozoides, pero no líquido, ver más abajo). Un total de 9 varones fueron asignados para recibir el tratamiento hormonal; 7 machos sin presencia de espermatozoides y 2 con presencia de espermatozoides (índice espermático 1). Los machos tratados con rGth se dividieron en dos grupos que recibieron el mismo tratamiento, pero en diferentes momentos del período experimental. La razón fue asegurar la disponibilidad de machos espermiantes para la inducción del desove cuando las hembras completaron el crecimiento vitelogénico. El grupo 1 de machos (n = 4 tratados, n = 3 controles) inició el tratamiento en la semana 1 y el grupo 2 (n = 5 tratados, n = 3 controles) en la semana 3 (Fig. 2). El objetivo del tratamiento era aplicar rGths según su papel descrito en la espermatogénesis. Se administraron dosis crecientes de rFsh (6, 9 y 12 µg kg-1) en la espermatogénesis temprana y niveles altos (12 µg kg-1) durante el crecimiento testicular (Fig. 3). No se administró rLh durante la espermatogénesis temprana, ni rFsh ni rLh (12 µg kg-1 de rFsh y rLh) durante las etapas medias del crecimiento testicular y solo se administró rLh (12 µg kg-1) en las etapas tardías para inducir la maduración del esperma18. . El grupo 1 recibió el tratamiento durante un total de 12 semanas mientras que el grupo 2 durante 10 semanas. En la semana 9, el grupo 1 recibió una dosis de 12 µg kg-1 de rFsh en lugar de rLh, ya que se observó una reducción en la etapa de espermiación (consulte la sección “Inducción de la espermatogénesis y espermiación”). Las dosis estuvieron en el rango de estudios previos con hombres que utilizaron rGths producidas en células CHO6,7,8,9. A los machos de control se les inyectó 1 ml de solución salina por semana.

Esquema general del experimento. A las hembras que recibieron el tratamiento con rGths se les inyectó semanalmente hasta completar el crecimiento vitelogénico que tuvo lugar en un período máximo de 13 semanas, después de 13 administraciones. Las puntas de flecha indican el momento en el que las hembras individuales fueron inducidas a desovar (el número de hembras está indicado por el número en la parte superior). Las hembras de control recibieron un total de 12 inyecciones de solución salina. El grupo 1 de machos inició los tratamientos (tratamiento rGth y solución salina) en la semana 1, mientras que el grupo 2 en la semana 3.

Esquema del tratamiento hormonal de machos de mújol de cabeza plana. El asterisco indica el momento en que el grupo 1 recibió 12 µg kg−1 de rFsh en lugar de rLh. El verde indica la administración de rFsh y el azul indica la administración de rLh.

Para evaluar la progresión de la maduración, al inicio del tratamiento y semanalmente se aplicó un suave apretón en el abdomen ventral hacia la abertura urogenital para liberar los espermatozoides. El estadio de espermiación se determinó en una escala de 0 a 3 (0 = no fluido, 1 = fluido pero no se puede obtener muestra, 2 = fluido, 3 = muy fluido). Con este método, junto con el plasma seminal, sólo se liberan células maduras. Por lo tanto, para determinar el estadio de desarrollo en los machos, algunos machos fueron sacrificados al inicio (n = 2) y al final del tratamiento (n = 2 por grupo) y se extrajeron los testículos para procedimientos histológicos y medición del índice gonadosomático ( GSI: peso de los testículos/peso del pez × 100). Hacia el final del experimento (semanas 10 y 13), se recolectaron muestras de esperma de machos corredores, se registró el volumen total y se almacenó a 4 °C para el análisis de la calidad del esperma. También se tomaron muestras de sangre de machos tratados y de control cada 2 semanas de tratamiento.

Se siguieron tres tratamientos diferentes para la maduración y la inducción del desove. Se seleccionaron para la inducción del desove hembras que completaron el crecimiento vitelogénico (según lo determinado por biopsia gonadal) y machos con esperma (etapa de esperma 2 o 3). Los individuos fueron separados del grupo principal y sembrados en un tanque separado de 10 m3 por tratamiento. Los tres tanques separados tenían las mismas condiciones que el tanque de retención. Un macho en cada tanque de desove recibió una dosis de 24 µg kg−1 de rLh mientras que los demás siguieron el tratamiento hormonal descrito anteriormente, recibiendo 12 µg kg−1 de rLh. A las hembras seleccionadas se les inyectó por vía intramuscular (i) rLh de cebado y progesterona (P4) de resolución (Prolutex, Grupo IBSA, Italia) como en Ramos-Júdez et al.9 (ii) rLh para inyecciones de cebado y resolución o (iii) P4 para cebar y resolver inyecciones (dosis en la Tabla 1). Las inyecciones de cebado y resolución se administraron con un intervalo de 24:05 ± 0:40 h. Se tomaron muestras de ovario con una cánula y se examinaron antes de cada administración. La maduración y la inducción de la ovulación de las hembras de cada grupo de tratamiento se escalonaron en diferentes días consecutivos para separar los diferentes eventos de desove. La proporción de sexos fue de 1:2 o 1:3 (hembra:macho) por evento de desove dependiendo de la disponibilidad de machos. Después de todos los eventos de desove, los machos regresaron con el grupo principal al tanque inicial. En los casos en que las hembras ovularon y mostraron el vientre hinchado, pero no liberaron los óvulos, se aplicó el despojo manual.

Paralelamente, los ovocitos obtenidos de la canulación de hembras (n = 6) que habían recibido la inyección inicial de rLh (30 µg kg-1) se incubaron in vitro con diferentes hormonas. Se incubaron un total de 58,7 ± 29,9 ovocitos en un pocillo de una placa de 96 pocillos con 200 µL de medio L-15 de Leibovitz, ya sea sin hormona (control), rLh (concentraciones de 400, 200, 100, 50 y 10 ng mL-1), rFsh (400, 200, 100, 50 y 10 ng mL-1) o P4 (4000, 1000, 500 y 50 ng mL-1). Cada tratamiento se aplicó por triplicado a los ovocitos de cada hembra. Después de 48 h de incubación a 21 °C, los folículos se examinaron bajo un microscopio binocular y se contaron los ovocitos sin la capa folicular (ovulados) y los folículos intactos (no ovulados) para cada pocillo.

Se colocaron recolectores de huevos de salida de superficie (tamaño de malla de 500 μm) para recibir los huevos de los tanques y se inspeccionaron con frecuencia en busca de huevos. Cuando se observó el desove, los huevos se transfirieron a un balde de 10 L. El número de huevos por puesta (fecundidad) se estimó contando los huevos en submuestras por triplicado. Se observó una muestra de huevos (n = 50–100) bajo un microscopio y el porcentaje (%) de fertilización para cada lote de huevos desovados se determinó calculando el porcentaje de huevos que alcanzaron la etapa de 2 a 16 células. Los huevos para incubación se recogieron después de agitarlos cuidadosamente en el balde de 10 litros. Los huevos se incubaron a una densidad de 13,230 ± 7273 huevos L-1 en incubadoras de 30 L con las mismas condiciones que los tanques de almacenamiento de reproductores. Cada incubadora recibió una piedra de aire colocada en el centro para mantener los huevos en suspensión y evitar la acumulación de huevos en la superficie o el fondo de la incubadora. El número de huevos en cada incubadora se estimó mezclando la incubadora de manera homogénea y tomando tres muestras de 100 ml y contando los huevos en cada muestra. Los huevos se dejaron desarrollar durante un día y se estimó la tasa de supervivencia (porcentaje de huevos con embriones) en comparación con el porcentaje de fertilización con una muestra de huevos (n = 50–100) tomadas de la incubadora. Al día siguiente, se estimó volumétricamente el número de larvas eclosionadas en cada incubadora como para los huevos. En paralelo a las incubadoras de 30 L, los huevos fertilizados se transfirieron a pocillos individuales llenos de agua de mar estéril en una placa de cultivo celular de 96 pocillos (placa EIA) y se colocaron en una incubadora refrigerada a 21 °C por duplicado para cada desove y se revisaron diariamente hasta la última larva murió, para estimar la tasa de eclosión y la supervivencia de las larvas en condiciones de inanición como en Giménez et al.19. El porcentaje de supervivencia se calculó como el número de larvas vivas/total de larvas eclosionadas.

Se realizó una prueba preliminar para examinar el crecimiento y desarrollo de las larvas. El ensayo no se centró en la supervivencia ya que las instalaciones y el personal no estaban disponibles para proporcionar condiciones óptimas para las larvas. La cría de larvas se llevó a cabo en condiciones de mesocosmos20, con baja densidad larval en un tanque grande (6 larvas L-1, tanque de 1500 L) en condiciones más naturales o, al menos, menos estrictas que las utilizadas en la cría intensiva, y utilizando un sistema endógeno. floración de zooplancton marino salvaje, en su mayoría copépodos harpacticoides, junto con la adición periódica de rotíferos y nauplios de Artemia. El ensayo se llevó a cabo del 11 de noviembre al 18 de diciembre de 2020 utilizando larvas 4 días post eclosión (dph) que eclosionaron el 7 de noviembre, de una puesta obtenida con el tratamiento de desove rLh + rLh. Las larvas se sembraron en un tanque de 1500 L a 20 °C, fotoperíodo de 12 hL: 12 hD y se alimentaron con rotíferos durante 26 días (4 a 30 dph), seguidos de A. nauplii recién eclosionados (24–39 dph). Se agregó fitoplancton (una mezcla de Tetraselmis suecica e Isochrysis galbana) todos los días para mantener un medio verde, y cada dos días se evaluó la concentración de rotíferos para mantener una densidad de 5 podredumbre mL-1. Los nauplios de Artemia se agregaron cuando las larvas alcanzaron 4,3 mm TL (20 dph), siendo el alimento principal para las larvas después de 5 mm TL como lo sugieren Hagiwara et al.21.

Se tomaron muestras de diez larvas elegidas arbitrariamente a los 4, 6, 9, 11, 17, 23, 27, 32, 37 y 39 dph y se anestesiaron con MS-222. La longitud estándar se midió utilizando una cámara digital conectada a un analizador de imágenes (AnalySIS, SIS Gmbh, Alemania). También se utilizaron fotografías para estimar la presencia o ausencia de alimento en el intestino y para examinar el inflado de la vejiga natatoria, así como otros indicadores del desarrollo larvario.

Las muestras de ovario obtenidas mediante canulación y las porciones de testículo se conservaron en líquido de Bouin durante 24 h y se almacenaron en etanol al 70% hasta su procesamiento. Los tejidos deshidratados se incluyeron en parafina y se cortaron secciones de 3 μm. Las porciones de los testículos (de la parte anterior, media y posterior) se orientaron para obtener secciones horizontales. Las secciones cortadas se tiñeron con hematoxilina y eosina (Casa Álvarez, España) para evaluación morfológica. Los portaobjetos se examinaron bajo un microscopio óptico (Leica DMLB, Houston, EE. UU.).

Los ovocitos se clasificaron como lo describieron previamente Ramos-Júdez et al.9. Los ovocitos se clasificaron como previtelogénicos: con ovocitos de crecimiento primario (PG), que presentaban múltiples nucléolos situados en la vesícula germinal, o con ovocitos de alvéolos corticales (SGca), que presentaban pequeñas gotas de aceite y vesículas granulares en el ooplasma periférico. La incorporación de glóbulos de yema indicó etapas vitelogénicas: crecimiento secundario temprano (SGe), crecimiento secundario tardío (SGl) cuando los ovocitos alcanzaron ≥ 400 μm17 y ovocitos de crecimiento secundario completamente desarrollados (SGfg) cuando el crecimiento vitelogénico se completó con la fusión de la yema. gránulos y engrosamiento de la membrana vitelina. Los ovocitos se clasificaron como etapa de maduración de ovocitos (OM) cuando las gotas de aceite se fusionaban y el núcleo se colocaba a un lado del ovocito, lo que indica el inicio de la migración de vesículas germinales (GVM). Los ovocitos con estructura desintegrada e hipertrofia estaban en atresia22. El estadio de maduración de las hembras se determinó según el estadio más desarrollado de los ovocitos presentes. Además, el porcentaje de ovocitos en diferentes etapas de los ovarios entre semanas se calculó mediante la identificación de ≥ 50 ovocitos aleatorios por mujer cada semana.

Para evaluar muestras de testículos, se puntuó el número de espermatogonias tipo A y B (SPG), espermatocitos (SPC), espermátidas (SPD) y espermatozoides (SPZ) en 12 túbulos seminíferos seleccionados aleatoriamente de diferentes áreas (anterior, media y posterior) por muestra y se determinó el porcentaje de abundancia de cada tipo de célula germinal.

Se recolectaron muestras de esperma de machos corredores, para evaluación de calidad, en la semana 10 y en la semana 13 al final del período experimental. Las muestras se recolectaron en una jeringa de 1 mL evitando la contaminación con orina, heces y agua. El esperma se dividió en dos alícuotas, una se mantuvo como esperma sin diluir y la otra se diluyó 1:10 (1 parte de esperma + 9 partes de diluyente) en diluyente Marine Freeze® (IMV Technologies, L'Aigle, Francia)23 y ambas muestras se mantuvieron en Tubos Eppendorf a 4 °C hasta evaluación. El esperma se activó pipeteando 5 µL de la muestra de esperma (diluida o sin diluir) en un Eppendorf con, dependiendo de la concentración de esperma, 195, 295, 495 o 995 µL de agua de mar. Inmediatamente, se agitó el Eppendorf para mezclar completamente, luego se pipetearon 2 μL que contenían espermatozoides activados en una cámara de conteo ISAS (Sistema Integrado de Análisis de Espermatozoides, España), y se grabaron videos de las huellas de los espermatozoides activados 15 s después de la activación con el sistema CASA. SCA-VET-01 (Microptic, Barcelona, ​​España). Los videos se grabaron usando una cámara digital (Basler Ace ACA1300-200UC, Basler AG, Ahrensburg, Alemania) conectada a un microscopio óptico de contraste de fase (Nikon Eclipse Ci, Tokio, Japón) con un objetivo de contraste de fase negativo de × 10. Se determinaron los siguientes parámetros de los espermatozoides: (1) concentración de espermatozoides (spz mL-1), (2) motilidad de los espermatozoides (%), (3) espermatozoides de progresión rápida (%) y (4) velocidad de los espermatozoides (μm s-1). : la velocidad curvilínea (VCL), la velocidad en línea recta (VSL) y la velocidad promedio de trayectoria (VAP). El programa CASA se configuró para clasificar los espermatozoides móviles con un VCL de > 25 μm s-1 y los espermatozoides de progresión rápida con una rectitud (SRT = VSL/VAP × 100) de > 80 % y un VCL de > 80 μm s-. 1. Todas las muestras fueron analizadas el día de la recolección y 48 h después de la recolección. Las muestras recolectadas al final del experimento (semana 13) también se analizaron los días 1, 4, 6, 8, 11, 13 y 15 después de la recolección.

Se recogieron muestras de sangre y se centrifugaron a 3000 rpm a 4 °C durante 15 minutos y el plasma se almacenó a -80 °C hasta su análisis. Los niveles plasmáticos de 17β-estradiol (E2) y 11-cetotestosterona (11-KT) se analizaron mediante inmunoensayos enzimáticos (EIA) disponibles comercialmente (Cayman Chemical Company, EE. UU.). Los esteroides se extrajeron con metanol que se evaporó y los extractos se resuspendieron 1:10 (E2) o 1:100 (11-KT) en el tampón EIA.

Los datos se expresan como media ± desviación estándar (DE). Se utilizó una prueba de Chi-cuadrado para examinar la distribución entre grupos de peces que tenían diferentes etapas de maduración al comienzo del experimento, y si los peces que ovularon o desovaron tenían un estado de madurez determinado al comienzo del experimento. Se utilizaron las pruebas de Shapiro-Wilk y Levene para verificar la normalidad de la distribución de los datos y la homogeneidad de la varianza, respectivamente. Se utilizaron la prueba U de Mann-Whitney o la prueba de Kruskal-Wallis, seguida de la comparación por pares de Dunn, en datos con distribución no normal para comparar el diámetro de los ovocitos entre el grupo tratado y el de control dentro de una semana y entre semanas durante el experimento, respectivamente. Se utilizó ANOVA unidireccional seguido de la prueba post hoc de Holm-Sidak para examinar por separado las diferencias en las variables independientes de diámetro de ovocitos adultos, porcentaje de OM, huevos totales por hembra y fecundidad entre los tres tratamientos de desove. Las variaciones entre los grupos no fueron iguales para los datos de GSI, que se transformaron logarítmicamente y los grupos se compararon mediante la prueba de Brown-Forsythe y la prueba de comparaciones múltiples post-hoc de Games-Howell. Los datos de desove de los tratamientos de desove rLh + rLh y rLh + P4 (es decir, período de latencia, porcentajes de fertilización y eclosión) se compararon utilizando una prueba t de Student. Las diferencias en el porcentaje de OM y el diámetro de los ovocitos antes y después de las inyecciones de cebado o resolución, y el porcentaje de ovulación de los ovocitos incubados in vitro se examinaron mediante ANOVA de medidas repetidas unidireccionales (RM) con hembras individuales como sujeto. Se utilizó RM ANOVA de dos vías con comparación por pares mediante la prueba de Holm-Sidak para comparar E2 y 11-KT entre semanas y grupos de tratamiento. Los parámetros de calidad del esperma se compararon con un ANOVA RM unidireccional y bidireccional. En el ANOVA RM unidireccional, el sujeto fue el macho, el día de almacenamiento la variable independiente y los parámetros de calidad del esperma las variables dependientes. En el ANOVA RM de dos vías, el sujeto fue el macho, el tiempo de almacenamiento (0 o 48 h) y la dilución de la muestra (sin diluir o Marine Freeze®) fueron las variables independientes y los parámetros de calidad del esperma las variables dependientes. Se detectaron diferencias significativas a un nivel de significancia de P <0,05. Los análisis estadísticos se realizaron con SigmaPlot versión 12.0 (Systat Software Inc., Richmond, CA, EE. UU.), con la excepción de la prueba de Brown-Forsythe que se realizó con el software SPSS versión 20.0 (Armonk, NY: IBM Corp).

La inducción y finalización de la vitelogénesis (603 ± 8 µm) de hembras previtelogénicas y vitelogénicas tempranas se logró con un 100% de éxito en el grupo tratado con rGth; como se observó en las 12 hembras previtelogénicas y en las 9 hembras vitelogénicas tempranas. Ninguna hembra del grupo de control completó el crecimiento de ovocitos (Fig. 4a).

Diámetro medio de los ovocitos más grandes (n = 20 por hembra) en preparados húmedos en: (a) cada hembra (representada por una línea) que recibió el tratamiento rGth (n = 21) y hembras que recibieron inyecciones de solución salina (control) ( norte = 9). Los triángulos muestran el momento y el número de hembras que completaron el crecimiento vitelogénico y fueron seleccionadas para la maduración y la inducción de la ovulación, (b) diámetro medio de los ovocitos de las hembras tratadas con rGth alineados desde la finalización del crecimiento vitelogénico, el momento en que fueron seleccionadas para la maduración e inducción del desove. El crecimiento de los ovocitos está representado por una ecuación polinómica (cuadrática) de segundo orden (R2 = 0,9625).

Al comienzo del experimento, las mujeres en diferentes etapas de desarrollo ovárico se distribuyeron uniformemente entre los grupos de control y tratamiento (χ2 = 0,824; gl = 2; P = 0,662). Los grupos de control y rGths tenían 62 ± 7% de hembras en previtelogénesis (de las cuales 61 ± 7% y 23 ± 16% estaban en crecimiento primario y en etapa de alvéolos corticales, respectivamente) y 38 ± 7% en vitelogénesis temprana (Fig. 5a). , b) sin diferencias significativas en el diámetro inicial medio de los ovocitos más grandes (control = 164 ± 82 µm, tratados con rGth = 172 ± 72 µm). Aunque algunas hembras habían comenzado el crecimiento vitelogénico en la semana 0, los ovarios tenían principalmente ovocitos PG, algunos ovocitos de alvéolos corticales (SGca) con muy pocos ovocitos en la vitelogénesis temprana y algo de atresia (Fig. 5c, d, Fig. Suplementaria S1A).

Porcentaje de hembras en diferentes etapas de madurez del desarrollo gonadal en (a) el grupo control y (b) tratado con rGth, y evolución de la frecuencia porcentual de las etapas de desarrollo de ovocitos observadas en (c) el grupo control y (d) tratado con rGth en diferentes semanas del periodo experimental. El estado de madurez de las hembras estuvo determinado por el estadio de ovocitos más avanzado presente en las muestras. Para calcular el porcentaje de cada estadio de ovocitos, se clasificaron un total de 50 ovocitos aleatorios por hembra y se estimaron las proporciones. Cada sección de barra representa el porcentaje medio de ovocitos por etapa de hembras para cada semana. PG ovocito de crecimiento primario, paso de alvéolos corticales SGca, SGe crecimiento secundario temprano, SGl ovocito de crecimiento secundario tardío (≥ 400 µm), SGfg ovocitos de crecimiento secundario completamente desarrollados, migración inicial de vesículas germinales GVM.

Las hembras previtelogénicas en PG del grupo de control no mostraron un mayor desarrollo durante el experimento (Fig. 5a, Fig. Suplementaria S1D). El número de hembras con vitelogénesis temprana en el grupo de control disminuyó durante el experimento, al mismo tiempo hubo un aumento en la aparición de atresia folicular (Fig. 5a, c). Además, no se observaron diferencias significativas en el diámetro de los ovocitos entre semanas en el grupo de control (Fig. 4a). Por otro lado, el tratamiento hormonal indujo un crecimiento significativo (P < 0,001) del diámetro de los ovocitos. El grupo tratado con rGth mostró un aumento semanal significativo en el diámetro de los ovocitos (P <0,001) (Fig. 4a) y para la cuarta semana de tratamiento, todas las hembras (100%) habían progresado a vitelogénesis (Fig. 5b). En este punto, un grupo claro de ovocitos vitelogénicos era el más abundante en los ovarios (Fig. 5d, Fig. Suplementaria S1B). A partir de la sexta semana, diferentes hembras completaron el crecimiento de los ovocitos (Figura complementaria S1C) y la mayoría completó el desarrollo gonadal en las semanas 12 y 13. Para definir el patrón de crecimiento de los ovocitos en el grupo rGth, los ovocitos se alinearon desde la finalización del proceso vitelogénico. crecimiento y el crecimiento estuvo representado por una ecuación polinómica (cuadrática) de segundo orden y = 113,9 + 53,62 x − 1,234 x2 (R2 = 0,9625) (Fig. 4b). Se observó un mayor aumento en el diámetro de los ovocitos entre semanas (inyecciones) en etapas más tempranas, con ~50 µm por semana, mientras que se requirieron aproximadamente tres semanas (inyecciones) para crecer los últimos 50 µm para completar el crecimiento vitelogénico. Una vez calculado el volumen de ovocitos (V = 4/3 πr3), por el contrario, mostró un mayor incremento semanal (más de 5 veces mayor) en las últimas etapas de desarrollo en comparación con las primeras.

En cuanto a los niveles de E2, no se observaron diferencias significativas entre el grupo control y el tratado al inicio del experimento (0,67 ± 0,71 ng mL-1 y 0,68 ± 0,46 ng mL-1, respectivamente), mientras que se observó un aumento significativo (P < 0,001). Se observó cuando el grupo tratado completó el crecimiento vitelogénico (1,53 ± 0,70 ng mL-1) en comparación con ningún cambio en los controles (0,52 ± 0,25 ng mL-1) al final del experimento.

La espermiación se indujo en el 100% (n = 9) de los machos del grupo tratado con rGth. Todos los machos avanzaron desde un índice de esperma de 0 o 1 al inicio del experimento, lo que indica que no se pudo obtener una muestra de esperma, a un índice de esperma de 2 o 3, lo que indica que los machos tenían esperma fluido o muy fluido. Todos los machos de control tenían un índice de esperma 0, sin presencia de espermatozoides, al final del experimento.

Al comienzo del experimento, los machos con o sin presencia de espermatozoides se distribuyeron uniformemente entre los grupos de control y tratamiento (χ2 = 0,156; gl = 1; P = 0,693). Sólo el 20% (3 de 15 individuos; 1 del grupo control y 2 del grupo rGths) presentaron rastros de lecha muy viscosa, pero no suficientes para obtener una muestra (Fig. 6). La evaluación histológica de los testículos de dos peces en los que no se obtuvo semen luego de la presión abdominal al inicio del experimento, mostró que un macho presentó solo SPG dentro de los túbulos seminíferos, mientras que el otro macho presentó muchos SPG y algunos SPC, SPD y SPZ, pero muchos túbulos no tenían la luz central formada y los que sí la tenían, presentaban muy pocos espermatozoides (Figura complementaria S2A, B). Durante el período experimental, los machos del grupo de control no produjeron lecha fluida y sólo el mismo macho de seis (17%) produjo una pequeña gota de lecha viscosa en diferentes semanas. Al final del experimento, los testículos de dos machos control –el macho que en semanas anteriores presentó semen viscoso y un macho que nunca tuvo semen– contenían túbulos con mayor número de SPC que la situación inicial, pero no había presencia de SPD o SPZ (Figura complementaria S2C, D). Por el contrario, en el grupo rGth se observaron machos corredores con semen blanco fluido. Después de cinco semanas de tratamiento (3 semanas de tratamiento con rFsh y 2 semanas de tratamiento combinado de rFsh y rLh) ocho de nueve (89%) machos presentaron lecha; ya sea trazas viscosas (33%) o lecha fluida (56%) (Fig. 6). Con la aplicación de rLh se incrementó el número de machos con semen fluido. A las 7 semanas, el 100% de los machos espermaban con lecha fluida y los machos mantuvieron la lecha fluida hasta el final del experimento (semana 12), con la excepción de la semana 9 cuando un macho produjo lecha viscosa. Sin embargo, después de la aplicación de rFsh en el Grupo 1 y de continuar el tratamiento con rLh en el Grupo 2, se produjo nuevamente lecha fluida en la semana siguiente. En claro contraste con los machos de control, en la histología de dos machos tratados con rGth al final del experimento, los conductos de esperma del grupo rGth estaban completamente llenos de espermatozoides (Figura complementaria S2E, F) y los volúmenes de esperma oscilaron entre 0,25 a 2,89 ml. Además, los valores de GSI reflejaron el crecimiento de los testículos y los machos tratados con rGths tuvieron un GSI significativamente mayor (P = 0,026) en comparación con el grupo de control al final del experimento. Los machos antes del tratamiento hormonal (n = 2) y los machos de control al final del tratamiento (n = 2) mostraron testículos delgados y no desarrollados con GSI de 0,10 ± 0,05% y 0,06 ± 0,01%, respectivamente, mientras que los machos tratados con rGth al final del tratamiento. Al final del experimento (n = 2) presentaron testículos blancos bien desarrollados con 5,35 ± 1,25% GSI. En conjunto, los machos con índice de esperma 0 y 1 tenían células germinales predominantemente en las etapas de SPG y SPC en testículos no desarrollados (GSI ≲ 0,1) y los tratamientos con rGth indujeron el crecimiento de los testículos (GSI 5,35 ± 1,25%) y el desarrollo de células germinales para completar la espermatogénesis. y proporcionar testículos llenos de espermatozoides y espermiación fluida (índice 2 y 3).

Porcentaje de machos que no espermaron y con diferentes grados de esperma en (a) control (n = 6) y (b) grupo tratado con rGth (n = 9) durante el período de tratamiento de machos. Los machos se clasificaron como sin lecha (índice 0), trazas de lecha viscosa de la que no se pudo obtener muestra (índice 1), lecha blanca fluida (índice 2) y lecha blanca muy fluida (índice 3). Los datos del Grupo 1 (n = 4 machos tratados con rGth, n = 3 de control) desde la primera aplicación (semana 0) hasta el último control (semana 12) se combinaron con los datos del Grupo 2 (n = 5 machos tratados con rGth, n = 3 control) de la semana 0 a 10 para poder presentar los resultados.

Con respecto a los cambios de esteroides, el tratamiento con rGths tuvo un efecto significativo en el aumento de los niveles de 11-KT (P <0,001) en comparación con el grupo de control (Figura complementaria S3) que se mantuvo sin cambios significativos. En el grupo rGth, se obtuvieron valores crecientes de 11-KT durante el transcurso del experimento coincidiendo con la disponibilidad de machos espermiantes, con el máximo a las 8 semanas y una disminución después.

En cuanto a la calidad del esperma, el día de la recolección (0 h), los espermatozoides diluidos 1:10 en Marine Freeze tuvieron las siguientes características medias: motilidad de 58 ± 22%, tamaño de cabeza de 13 ± 5 µm2, 107 ± 24 µm s− 1 VCL, 92 ± 29 µm s-1 VAP, 70 ± 31 µm s-1 VSL, 67 ± 12% STR, 57 ± 16% LIN y 79 ± 11% WOB. Mientras que el 20 ± 16% de los espermatozoides móviles eran de progresión rápida y tenían una velocidad de 149 ± 17 µm s-1 VCL, 140 ± 20 µm s-1 VAP, 129 ± 21 µm s-1 VSL, 92 ± 2% STR, 86 ± 7% LIN y 93 ± 6% WOB. La variación entre los nueve machos fue amplia, con un porcentaje de motilidad de espermatozoides que oscilaba entre el 19 y el 89 %. La concentración media fue de 7,59 × 1010 espermatozoides ml-1 o 15,56 × 1010 espermatozoides kg-1. El esperma diluido en Marine Freeze® tuvo una motilidad significativamente mayor que el esperma sin diluir el día de la recolección (0 h) y 48 h después de la recolección (Figura complementaria S4). La motilidad de los espermatozoides no diluidos disminuyó significativamente desde el día 0 hasta las 48 h después de la recolección, en comparación con los espermatozoides diluidos que mantuvieron una motilidad similar. El esperma recolectado y diluido en Marine Freeze® al final del experimento (semana 13) mantuvo una motilidad similar durante 6 días de almacenamiento a 4 °C (días de prueba 0, 1, 2, 4 y 6) con una variación de 41,1 ± 20,0 a 70,2 ± 17,3% antes de disminuir significativamente desde el día 4 (70,2 ± 17,3%) al día 8 (11,7 ± 5,1%), mientras que el día 6 fue intermedio (41,1 ± 20,0%).

Se seleccionaron hembras de salmonete de cabeza plana que habían completado el crecimiento vitelogénico (disponibles sólo en el grupo rGth) para la inducción del desove después de tres tratamientos diferentes. Las muestras de gónadas se examinaron antes de las inyecciones de cebado y después de las 24:05 ± 0:40 h, justo antes de las dosis de resolución. Los ovarios de las hembras seleccionadas estaban compuestos por SGfg con un tamaño promedio de 603 ± 8 µm y el 76% (16 de 21) de las hembras presentaron 17 ± 23% de ovocitos que ya habían iniciado OM con la migración de la vesícula germinal (Fig. 5d); el núcleo se había descentrado y había un pequeño grado de fusión de los gránulos de yema y las gotitas de lípidos, pero sin una sola masa de yema grande. No se encontraron diferencias significativas en el diámetro de los ovocitos ni en el porcentaje de MO entre las hembras que recibieron diferentes tratamientos de desove. Después de las inyecciones de preparación (24 h), el 100% de las hembras que recibieron rLh habían entrado en OM con la mayoría de los ovocitos (96 ± 9%) en GVM tardía con coalescencia de la yema (Figura complementaria S5). Mientras tanto, las que recibieron P4 no mostraron un aumento significativo en el porcentaje de GVM (35 ± 35%) respecto a la etapa inicial (12 ± 5%), mostrando que la mayoría de los ovocitos fueron retenidos en la etapa de crecimiento secundario.

Las proporciones de hembras que ovularon o desovaron no variaron entre el estado de madurez inicial de las hembras al inicio del experimento (χ2 = 1.150; gl = 2; P = 0.563 · 0.001; χ2 = 2.149; gl = 2; P = 0.342) . En el grupo rLh + P4, el 100% de las hembras ovularon y ocho de nueve hembras (89%) desovaron en el tanque 16:36 ± 1:56 después de la inyección de resolución. En el grupo rLh + rLh, el 100% de las hembras (n = 6) ovularon y desovaron 16:51 ± 2:22 h después de la inyección resolutiva. Mientras tanto, tres de seis peces (50%) bajo el tratamiento con P4 + P4 ovularon pero sólo uno (17%) liberó algunos huevos (177.667 huevos) 24:30 h después de la administración de la dosis resolutiva. El número promedio de huevos desovados y la fecundidad femenina para cada tratamiento hormonal fueron similares (Tabla 1). Aquellas mujeres que no ovularon en el grupo de tratamiento P4 + P4 no mostraron un aumento significativo en la OM después del segundo P4 (Figura complementaria S5). Los huevos de las hembras que ovularon y no desovaron se extrajeron aplicando una suave presión abdominal para liberar todos los huevos ovulados de la hembra. Los óvulos despojados no tenían la apariencia de óvulos viables y formaban una masa globular densa casi sin líquido ovárico.

La incubación in vitro de ovocitos que habían iniciado la OM confirmó la ovulación y el desove in vivo. Los porcentajes más altos de ovulación (> 50%) se obtuvieron de ovocitos tratados con P4 (4000, 1000, 500 y 50 ng mL-1) o 100 ng mL-1 de rLh (Figura complementaria S6). Todos los ovocitos tratados con P4 y los ovocitos tratados con 400, 200 y 100 ng mL-1 de rLh tuvieron porcentajes significativamente (P < 0,05) más altos (> 34%) de ovulación que los ovocitos no tratados (control) y los ovocitos tratados con rFsh o 10 ng mL−1 de rLh (< 8%). Los ovocitos tratados con 50 ng mL-1 de rLh tuvieron un porcentaje de ovulación (21,3 ± 18,5%) intermedio entre los grupos de mayor y menor ovulación.

No se encontraron diferencias significativas en los parámetros de latencia, producción de huevos y calidad; fecundidad, porcentajes de fertilización, supervivencia embrionaria o eclosión, en aquellas hembras que recibieron rLh como dosis cebadora y rLh o P4 como inyecciones resolutivas (Tabla 1). Tampoco hubo diferencias entre las hembras que se encontraban en diferentes etapas de madurez al comienzo del experimento. La fecundidad total media fue de 1.738.798 ± 868.950 huevos por hembra (la fecundidad relativa fue de 1.245.600 ± 552.117 huevos kg-1 pc) con 54 ± 21% de fertilización. Por el contrario, los huevos desovados de una hembra que recibió P4 + P4 no fueron fertilizados (0% fertilización).

No se observaron diferencias en la calidad de huevos y larvas entre los grupos rLh + rLh y rLh + P4. Los porcentajes de supervivencia y eclosión de embriones fueron 64 ± 22% y 57 ± 24%, respectivamente. La eclosión en placas EIA de 96 pocillos fue del 96 ± 3 %. Los huevos con embrión midieron 0,83 ± 0,02 mm de diámetro (Fig. 7a) y la longitud de las larvas al momento de la eclosión fue de 1,86 ± 0,14 mm de longitud total (TL). La tasa de supervivencia larvaria en las placas de 96 pocillos a 21 °C fue de 85 ± 18 % a 2 dhp, 67 ± 18 % a 5 dhp, 55 ± 17 % a 9 dph y disminuyó hasta 8 ± 11 % a 12 dph. A los 14 dph, todas las larvas estaban muertas.

Mugil cephalus embriones, larvas, estadios postlarvales y juveniles. (a) Embrión con la región de la cabeza formada y pigmento oscuro que cubre casi todo el cuerpo y el glóbulo de aceite (OG), (b) larvas recién nacidas, (c) larvas a 2 dph con ojos ya pigmentados, (d) larvas a 3 dph con las piezas bucales completamente formadas y funcionales, (e) larvas a 9 dph con el glóbulo de aceite todavía presente, (f) larvas a 19 dph con el glóbulo de aceite completamente absorbido y (g) con una vejiga natatoria hiperinflada (SB), ( h) postlarvas a 32 dph, (i) postlarvas a 37 dph, (j) juveniles a 39 dph. Barra de escala: 500 μm en (a – g), 1 mm en (h – j).

Las larvas utilizadas para la prueba preliminar de cultivo de larvas midieron 2,1 ± 0,05 mm TL al momento de la eclosión, mostrando una masa yema homogénea con una gota de aceite redonda en la parte posterior del saco vitelino (Fig. 7b). Los ojos comenzaron a pigmentarse entre los días 1 y 2 dph. Las mandíbulas superior e inferior estaban bien desarrolladas y la boca estaba abierta desde 3 dph (2,93 ± 0,08 mm TL, Fig. 7c, Fig. Suplementaria S7) cuando las larvas habían consumido la mayor parte de las reservas de yema y solo quedaba el glóbulo de aceite (Fig. .7d). La etapa de preflexión duró de 4 a 19 dph con la yema y la gota de aceite completamente absorbidas (11 dph). La formación de la vejiga natatoria comenzó alrededor del día 4 al 6 (2,9 a 3,11 mm TL, figura complementaria S7), visible ventralmente debajo de la notocorda. La actividad natatoria de las larvas aumentó durante la formación y agrandamiento de la vejiga natatoria, aunque varias larvas nadaron en el fondo del tanque o permanecieron flotando en la superficie del agua sin moverse y/o alimentarse de rotíferos debido a una hiperinflación del nado. vejiga (Fig. 7g). La mayoría de estas larvas murieron y, para reducir esta mortalidad, la intensidad de la luz se redujo a 500 lx desde 9 dph hasta el final de la prueba de cría. La flexión de la cola se completó cuando las larvas alcanzaron 3,7 mm de longitud, mientras que la etapa posterior a la flexión se extendió durante varios días (20 a 30 dph, 4,3 a 5,3 mm TL, figura complementaria S7) hasta que se completaron la aleta caudal y la horquilla. Al final de la prueba (día 39), todos los peces parecían adultos y se consideraron juveniles (Fig. 7j). El desarrollo de las larvas de Mugil cephalus y de los estadios poslarvares a juveniles se muestra en la Fig. 7 y en la Fig. complementaria S7.

El salmonete de cabeza plana (Mugil cephalus) mantenido en condiciones de cautiverio intensivo experimentó disfunciones reproductivas en las primeras etapas del proceso de maduración y tanto los machos como las hembras necesitaron ayuda para inducir la vitelogénesis, la maduración de los ovocitos, la ovulación, mejorar la espermatogénesis, la espermiación y el desove. El presente estudio muestra que rFsh y rLh pueden usarse como un método confiable para inducir y completar la oogénesis a partir de la previtelogénesis, producir lecha e inducir el desove voluntario espontáneo en tanque, en el 100% de los peces experimentales para proporcionar huevos y larvas viables y de buena calidad.

Al observar la etapa de desarrollo ovárico al inicio del experimento, se encontró una variedad de disfunciones en las mujeres; Los peces fueron detenidos en etapas que iban desde la previtelogénesis como en Ramos-Júdez et al.9 hasta la vitelogénesis temprana como se informó en otras áreas del Mediterráneo15. Sin embargo, en el presente estudio, los ovarios de las hembras vitelogénicas tempranas al inicio del experimento tenían pocos ovocitos vitelogénicos que no estaban distribuidos homogéneamente y, de hecho, los ovocitos previtelogénicos eran la etapa de desarrollo más abundante en todas las hembras. Las hembras que recibieron el tratamiento con rFsh y rLh, como lo describieron previamente Ramos-Júdez et al.9, mostraron una nidada uniforme de abundantes ovocitos reclutados en la vitelogénesis y siguieron el desarrollo ovárico típico en esta especie. Mugil cephalus tiene un desarrollo de ovario sincrónico en grupo con un grupo de ovocitos que maduran anualmente después de un único episodio de desove24. La administración hormonal rGth tuvo un 100 % de éxito en la inducción de la vitelogénesis desde la previtelogénesis (12 de 12 mujeres) y la vitelogénesis temprana (9 de 9 mujeres) hasta completar el crecimiento vitelogénico. En comparación, las hembras control que se encontraban en vitelogénesis temprana permanecieron sin avances en el desarrollo de las gónadas durante el experimento y presentaron atresia, lo que puede indicar una falta de estimulación de los ovocitos vitelogénicos para desarrollarse más16. Las hembras de control previtelogénicas no mostraron mayor desarrollo. Esta observación contrasta claramente con Aizen et al.15, en los que hasta el 20% de las hembras de control desarrollaron ovocitos maduros sin estimulación hormonal. La finalización de la vitelogénesis en las hembras tratadas con rGth estuvo acompañada por un aumento en los niveles plasmáticos de E2, que no se observó en los controles, lo que muestra la estimulación gonadotrópica del ovario por parte de rGths. Ramos-Júdez et al.9, utilizando los mismos rGths, obtuvieron un resultado casi idéntico con un aumento de los niveles plasmáticos de E2 y ocho de cada nueve (89%) de las hembras tratadas completaron la ovogénesis.

El tratamiento con rGth en machos indujo y mejoró la espermatogénesis y la espermiación, ya que el 100 % de los machos tratados produjeron semen fluido durante 8 semanas o más. En comparación, los machos de control permanecieron sin esperma fluido durante el experimento. El examen histológico de machos en diferentes etapas de espermiación mostró que los machos cautivos iniciales o de control que no presentaban espermatozoides o presentaban una pequeña gota de esperma viscoso tenían testículos no desarrollados con un GSI bajo (≲ 0,1%), predominantemente SPG y SPC y poco o ningún SPD. o SPZ. En comparación, el examen histológico mostró que los machos tratados con rGth tenían testículos bien desarrollados con un GSI significativamente mayor (5,35 ± 1,25%), que era 50 veces mayor que el de los machos de control, y los testículos estaban llenos completamente con SPZ y sin SPG o SPC. Aunque hubo un crecimiento significativo, quizás se requiera cierta precaución al extrapolar la histología de dos peces a los otros individuos en los grupos de control y rGth. Había pocos machos disponibles y la n para histología se redujo para asegurar suficientes machos para el tratamiento y el desove correctos. Toda la evidencia indica que los rGths han inducido la espermatogénesis de un gran número de células germinales desde las primeras etapas (SPG y SPC) hasta SPZ. Claramente, se requiere más trabajo para confirmar esta acción correcta y se debe realizar un estudio específico sobre el efecto directo de cada rGth en el desarrollo de los testículos y en el patrón de administración para consolidar las conclusiones. Sin embargo, como se sugiere en el presente estudio, otros estudios han inducido con éxito la espermatogénesis con rGths, es decir, en anguila europea sexualmente inmadura6, anguila japonesa inmadura25,26,27 y lenguado senegalés maduro7,8. Peñaranda et al.6 representan un estudio específico que probó diferentes combinaciones en la aplicación de rFsh y rLh homólogas (producidas por Rara Avis Biotec, SL como en el presente estudio) en anguila europea inmadura que condujeron a diferentes desarrollos testiculares incluyendo diferentes grados de espermiación. . Los efectos biológicos de los rGths en los hombres también se evaluaron a través de los niveles plasmáticos de 11-KT, que es el principal andrógeno responsable del desarrollo testicular1,18,28. El tratamiento con rGth aumentó significativamente los niveles de 11-KT en el plasma de los machos tratados en comparación con los machos de control. La concentración de 11-KT en plasma en los machos tratados aumentó gradualmente en respuesta a la aplicación de rFsh y rLh, a medida que avanzaba la madurez con la presencia de espermatozoides y el aumento de la fluidez del semen obtenido en todos los machos tratados a partir de las 5 semanas. Los niveles de 11-KT medidos, de 0,1 a 28 ng mL-1, estaban en el rango de niveles medidos previamente en machos de salmonete de cabeza plana tratados con implantes de 17α-metiltestosterona para mejorar la espermatogénesis y la espermiación15.

Se obtuvieron mayores cantidades de lecha fluida (0,25 a 2,89 ml) en el presente estudio en comparación con Ramos-Júdez et al.9 (máximo ~ 0,25 ml). El aumento de la producción de espermatozoides puede deberse al diferente patrón y dosis de administración de rGths, que incluyeron un período más largo y dosis más altas de rLh. La calidad del esperma fue variable entre los nueve machos tratados con rGth con parámetros medios adecuados de motilidad y velocidad de calidad del esperma. El volumen de esperma obtenido estuvo entre los más altos reportados para Mugil cephalus maduro salvaje, como de 0,1 a 2 ml29 y la concentración fue dos potencias a diez (1010) mayor que la reportada previamente (108)29, lo que indica que un mayor grado de dilución durante la espermiación , que se atribuye a la acción de Lh30, sería deseable. El diluyente Marine Freeze® fue eficaz para mantener la calidad del esperma durante 6 días de almacenamiento en frío a 4 °C, lo que también indicó que el esperma era de buena calidad.

Desde un punto de vista aplicado, el desarrollo de los machos se sincronizó con la finalización de la vitelogénesis de las hembras, haciéndolas disponibles para los eventos de desove. Los machos seleccionados tenían esperma fluido y se les administraron 12 o 24 µg kg-1 rLh para estimular la espermiación y el comportamiento reproductivo. Respecto a las hembras se aplicaron tres tratamientos para inducir la maduración de los ovocitos, la ovulación y el desove. La aplicación de 30 µg kg-1 rLh como inyección de cebado indujo la maduración de los ovocitos con migración de la vesícula germinal en el 100% de las hembras cuando se revisó antes de la aplicación de la dosis resolutiva (24 h después de la dosis de cebado). Las siguientes inyecciones de resolución de 40 mg kg-1 P4 o 30 µg kg-1 rLh indujeron que el 100% de los peces ovularan, y el 89% (resolución de P4) o el 100% (resolución de rLh) de los peces al desove en el tanque, con una media de porcentaje de fertilización de 54 ± 21% indicando el éxito en la aplicación de ambos tratamientos. El éxito in vivo de las dosis de resolución fue confirmado por el éxito de P4 y rLh para inducir la ovulación in vitro después de la dosis inicial de rLh. La prueba in vitro indicó la importancia de la selección de una dosis correcta de rLh para la inducción de la ovulación, ya que la respuesta de los ovocitos fue diferente dependiendo de la concentración de rLh en el medio. De lo contrario, las dosis bajas de P4 fueron tan efectivas para inducir la ovulación como las dosis altas, lo que sugiere que sería posible un refinamiento en la dosis de P4 aplicada in vivo. A diferencia de las mujeres que recibieron rLh como inyección inicial, las mujeres que recibieron P4 no habían iniciado OM 24 h después de la dosis inicial. La dosis resolutiva de P4 no tuvo efecto en el 50% de las hembras, mientras que el otro 50% de las hembras ovuló, y de esto, solo una hembra (17%) desovó huevos que no tuvieron fertilización. Aunque P4 como tratamiento de cebado y resolución indujo la ovulación, todo el proceso de maduración y ovulación se concentró en menos de 24 h después de aplicar la dosis de resolución. En comparación, las hembras que recibieron rLh como preparación completaron la OM y la ovulación durante 40:45 ± 2 h iniciando la OM después de la dosis de preparación y completando la OM, la ovulación y el desove después de la dosis de resolución. Es posible que la ovulación fuera inducida por la doble P4 a pesar de que la OM no hubiera sido inducida adecuadamente, lo que indica la importancia en este proceso de la Lh o de los factores inducidos por Lh como lo indicaron previamente Ramos-Júdez et al.9. En ese estudio, solo las mujeres que recibieron la dosis inicial más alta de rLh (30 μg kg-1) pasaron a OM en comparación con las mujeres que recibieron una dosis inicial más baja de rLh (15 μg kg-1), que no desarrollaron OM. En conjunto, la acción de las hormonas parece confirmar las funciones descritas1,16, ya que se requirieron dosis altas de rLh para inducir la maduración de los ovocitos y se necesitaron rLh o P4 después de la dosis inicial de rLh para inducir la ovulación y el desove.

Los dos tratamientos hormonales, rLh + rLh y rLh + P4, indujeron el desove espontáneo en tanque de un gran número de huevos fertilizados. Por lo tanto, el tratamiento rGth no solo indujo la gametogénesis, sino también el comportamiento reproductivo de ambos sexos para lograr un cortejo exitoso que condujera al desove y fertilización exitosa de los gametos liberados. La presencia de machos de buena calidad en el tanque con lecha fluida también puede haber sido un factor decisivo para el éxito del desove. Además, también podría haber sido importante una proporción adecuada de sexos entre hombres y mujeres. En el presente estudio, se colocaron juntos proporciones de macho a hembra de 2:1 o 3:1 y los machos observaron el comportamiento típico de apareamiento (nadar cerca de la hembra, empujar el abdomen con la cabeza y el cuerpo, dejar de nadar momentáneamente12) cuando las hembras tenían el vientre hinchado. Además, los datos del presente estudio indican que se pueden obtener óvulos de alta calidad con hasta un 80% de fertilización mediante la inducción de oogénesis por rFsh y rLh en hembras previtelogénicas. La recuperación de huevos flotantes de buena calidad de hembras que desovaron con machos tratados contrasta notablemente con el informe de Ramos-Júdez et al.9 en el que no se observó desove espontáneo después de cebar rLh y resolver el tratamiento de desove P4. Ramos-Júdez et al.9 no observaron comportamiento de desove en peces tratados con rGth y, por lo tanto, se extrajeron los gametos y se fertilizaron artificialmente para obtener un porcentaje de fertilización del 0,4%. Por lo tanto, el presente estudio sugeriría que otros factores como un retraso en el despojo de los huevos coincidiendo con el proceso de sobremaduración del huevo como lo afirman Ramos-Júdez et al.9 pueden haber resultado en los bajos porcentajes de fertilización en ese estudio en lugar de la aplicación del tratamiento rGth per se.

Las comparaciones del éxito del desove (número de peces que desovaron a partir del total inyectado), tasas de fertilización y fecundidades en otros estudios con salmonetes de cabeza plana son limitadas debido a diferencias en la metodología y la etapa inicial de desarrollo gonadal de los individuos. Algunos estudios han intentado mejorar la vitelogénesis, como la administración de 5 mg kg-1 de domperidona (Dom) o en combinación con implantes de 10 µg kg-1 de agonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHa), en los que tasas más bajas de hembras completamente maduras se obtuvieron (50-85%)15. Muchos otros estudios trabajaron directamente con la captura de hembras completamente maduras y aplicaron diferentes tratamientos para inducir la maduración de los ovocitos y el desove. Por ejemplo, Aizen et al.15 aplicaron GnRHa (10 µg kg-1 de cebado, 20 µg kg-1 de resolución) combinado con metoclopramida (15 mg kg-1 de cebado y resolución), El-Gharabawy y Assem31 inyectaron de 20 a 70 mg kg-1. −1 extracto de hipófisis de carpa o 10.000 UI de pescado−1 hCG como preparación y una o dos inyecciones de resolución de 100–200 µg kg-1 de GnRHa, Besbes et al.32 tratados con una dosis de preparación de 10.000 UI kg-1 de hCG y resolución de 10.000 UI kg-1 de hCG y 200 µg kg-1 de GnRHa, mientras que Vallainc et al.33 inyectaron 200 µg kg-1 de GnRHa. Esos tratamientos dieron como resultado respectivamente: (i) 85% de éxito en el desove con porcentajes de fertilización bajos (< 40%) a altos (< 90%) y fecundidades de 1,649,000 huevos kg-1 pc, (ii) 40% de éxito en el desove con 75 a 80 % de fertilización y fecundidades de 1.395.000 huevos kg-1 pc, (iii) 100% de éxito con 63% de fertilización pero bajas fecundidades de 418.945 huevos kg-1 pc, y (iv) 58% a 100% de éxito con 83 ± 14% de fertilización y fecundidades de 799.000 ± 109 huevos kg-1 pc. En general, estos estudios mostraron un éxito de desove muy variable y/o porcentajes de fertilización variables, mientras que el presente estudio presenta un éxito de desove confiable, del 85 al 100% dependiendo del tratamiento de desove, con una de las fecundidades más altas de 1.245.600 ± 552.117 huevos kg. −1 bw obtenido de hembras que fueron inducidas con éxito a partir de previtelogénesis.

Con respecto a la calidad de los huevos fertilizados incubados en placas de 96 pocillos, el 96 ± 3% de los huevos fertilizados desarrollaron embriones y eclosionaron, lo que indica una alta calidad del huevo. Además, las larvas sobrevivieron hasta 13 días a 21 °C sin alimentación exógena, lo que se considera una gran mejora en comparación con el estudio anterior de Ramos-Júdez et al.9, en el que las larvas no sobrevivieron más de 4 dph a 24 °C. No solo las larvas sobrevivieron más tiempo sin la aplicación de alimentación externa, sino que también las larvas criadas en condiciones de mesocosmos demostraron potencial para desarrollarse hasta ser juveniles, lo que indica que los huevos y larvas obtenidos después de la inducción de gametogénesis con rFsh y rLh podrían suministrar un criadero. De hecho, el desarrollo y crecimiento larvario en nuestro estudio, utilizando condiciones de cría de mesocosmos, fue muy similar al de otros estudios publicados, ya sea en condiciones intensivas o extensivas31,32,34,35. La mayoría de estos estudios, enfatizaron los efectos de la adición de algas a los tanques de cría (técnica de agua verde) como la mejor manera de optimizar la alimentación de las larvas de los rotíferos debido a su efecto no sólo de facilitar el contraste sino también de mejorar el estado nutricional y/o de salud. de los rotíferos36. El crecimiento larvario en tamaño fue similar a otros estudios32,33, con las larvas midiendo 2,1 mm TL al eclosionar y 2,96 mm TL a los 4 dph, seguido de un crecimiento estancado entre 4 y 11 dph cuando las larvas alcanzaron los 3,5 mm TL. El crecimiento se aceleró de 13 a 35 dph cuando alcanzaron 5 mm LT y luego hasta el día 39 cuando alcanzaron casi 7 mm LT. El crecimiento exponencial registrado en el presente estudio fue similar al descrito por Besbes et al.32. Por lo tanto, fue prometedor que las larvas criadas en los mesocosmos demostraran un crecimiento y desarrollo similar al de otros estudios sobre larvas de salmonete gris de cabeza plana, lo que indica el potencial para la producción en criadero de larvas a partir de adultos a los que se les había inducido gametogénesis con rGths.

Se han descrito dos periodos críticos37 durante la cría larval de salmonete de cabeza plana: uno a los 2-3 días post eclosión debido a la reabsorción del saco vitelino, una disminución de las reservas lipídicas y un aumento de la gravedad específica de las larvas, hundiéndose hasta el fondo del tanque y mueren gradualmente38, y el otro, entre 8 y 11 dph durante la formación de la vejiga natatoria con un inflado excesivo, especialmente en sistemas de cría intensivos (“artificiales”) (Nash et al.39; Nash y Kuo,40). Estos períodos justificarían las mortalidades más altas de 85 ± 18% de supervivencia a 2 dph a 55 ± 17% a 9 dph y 8 ± 11% a 12 dph observadas en larvas mantenidas en placas de 96 pocillos sin alimentación exógena. Aunque la supervivencia no era el objetivo de las larvas que se criaban en los mesocosmos, el principal problema de mortalidad encontrado fue la hiperinflación de la vejiga natatoria. Las larvas afectadas permanecieron flotando en la superficie del agua sin moverse y/o alimentándose de rotíferos. Esta sobreinflación se ha observado en larvas de otros peces marinos, como las larvas de corvina (Argyrosomus regius)41, y a menudo se asocia con condiciones estresantes como una alta intensidad de luz, el uso de un fotoperíodo prolongado, la introducción demasiado temprana de la presa durante la cría de las larvas o alta densidad larvaria42,43,44 que induce a las larvas a tragar demasiado aire en la superficie del agua induciendo la hipertrofia de la vejiga natatoria.

El enfoque descrito en el presente estudio para inducir la ovogénesis desde la previtelogénesis o vitelogénesis temprana hasta la finalización del crecimiento de los ovocitos y el desove utilizando gonadotropinas recombinantes de cadena sencilla (rFsh y rLh) producidas en células CHO, ofrece replicabilidad y garantiza un alto éxito en el desove y la alta producción de huevos. calidad en salmonete de cabeza plana. Fue significativo que, además de inducir la maduración desde la gametogénesis temprana hasta la producción de gametos masculinos y femeninos viables, los rGths también indujeran los procesos y la cascada de hormonas y feromonas que controlan el comportamiento reproductivo y el cortejo exitoso tanto en hembras como en machos. Desde un punto de vista aplicado, el presente protocolo proporciona un control total de la reproducción con la administración semanal a largo plazo de rGth. El protocolo proporcionó altas fecundidades de hembras de salmonete de cabeza plana (~ 1.700.000 huevos hembra-1), con fertilización y eclosión de ~ 50% de los huevos desovados. Estas fecundidades indican que la inducción de 6 a 7 hembras (~ 1 kg) por temporada podría permitir una producción en el criadero de ~ 1 millón de alevines, según las supervivencias reportadas en la literatura. Esto reduciría la necesidad de muchos criadores y la cantidad de hormonas utilizadas. Además, el presente protocolo probablemente pueda aplicarse para desarrollar programas de reproducción y desove fuera de temporada y en otras especies de peces detenidas en la previtelogénesis, no sólo para la acuicultura, sino también con fines de conservación.

Mañanós, E., Duncan, N. & Mylonas, C. Reproducción y control de la ovulación, espermiación y desove en peces de cultivo. En Methods in Reproductive Aquaculture: Marine and Freshwater Species (eds Cabrita, E. et al.) 3–80 (CRC Press, 2009).

Google Académico

Mylonas, C. y Zohar, Y. Promoción de la maduración de los ovocitos, la ovulación y el desove en peces de cultivo. En El ovocito de pescado: de los estudios básicos a las aplicaciones biotecnológicas (ed. Babin, PJ) 437–474 (Springer, 2007).

Capítulo Google Scholar

Molés, G. et al. Generación y uso de gonadotropinas recombinantes en peces. Comp. general. Endocrinol. https://doi.org/10.1016/j.ygcen.2020.113555 (2020).

Artículo PubMed Google Scholar

Kobayashi, M. y col. Actividad biológica in vivo de gonadotropinas recombinantes de peces de colores producidas por baculovirus en larvas de gusanos de seda. Acuicultura 256, 433–442 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Aizen, J., Hollander-Cohen, L., Shpilman, M. y Levavi-Sivan, B. LH de carpa recombinante biológicamente activa como agente inductor del desove de la carpa. J. Endocrinol. Rev. 232, 391–402 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Peñaranda, DS et al. Uso de gonadotropinas recombinantes específicas para inducir la espermatogénesis y la espermiación en la anguila europea (Anguilla anguilla). Teriogenología 107, 6-20 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Chauvigné, F. et al. Hacia el desarrollo de terapias hormonales basadas en gonadotropinas recombinantes para aumentar la fertilidad en el lenguado senegalés. MÁS UNO 12, e0174387 (2017).

Artículo PubMed PubMed Central Google Scholar

Chauvigné, F. et al. Efectos estacionales y dependientes de la dosis de las gonadotropinas recombinantes sobre la producción y calidad del esperma en el pez plano Solea senegalensis. comp. Bioquímica. Fisiol. Un mol. Integral Fisiol. 225, 59–64 (2018).

Artículo PubMed Google Scholar

Ramos-Júdez, S. et al. Proporcionar terapias basadas en gonadotropinas recombinantes que inducen la ovogénesis a partir de ovocitos previtelogénicos para producir larvas viables en un teleósteo, el salmonete de cabeza plana (Mugil cephalus). Acuicultura 536, 736418. https://doi.org/10.1016/j.aquaculture.2021.736418 (2021).

Artículo CAS Google Scholar

McDonough, C., Roumillat, WA y Wenner, CA Diferenciación sexual y desarrollo de gónadas en salmonete rayado (Mugil cephalus L.) de los estuarios de Carolina del Sur. Pez. Toro. 103, 601–619 (2005).

Google Académico

González-Castro, M. & Minos, G. Sexualidad y reproducción de Mugilidae. En Biología, ecología y cultivo de salmonetes (eds Crosetti, D. & Blaber, SJM) 227–263 (CRC Press, 2016).

Google Académico

Whitfield, AK, Panfili, J. y Durand, J.-D. Una revisión global del cosmopolita salmonete de cabeza plana Mugil cephalus Linnaeus 1758 (Teleostei: Mugilidae), con énfasis en los aspectos de biología, genética, ecología y pesca de este aparente complejo de especies. Rev. Pescado Biol. Pez. 22, 641–681 (2012).

Artículo de Google Scholar

De Monbrison, D. y col. Aceleración del desarrollo gonadal e inducción del desove en el mújol mediterráneo (Mugil cephalus): estudios preliminares. Bamidjeh 49, 214-221 (1997).

Google Académico

Yashouv, A. Informe preliminar sobre el desove inducido de M. cephalus (L.) criado en cautiverio en estanques de agua dulce. Bamidgeh 21, 19-24 (1969).

Google Académico

Aizen, J., Meiri-Ashkenazi, I., Tzchori, I., Sivan, B. y Rosenfeld, H. Mejora del desove del salmonete (Mugil cephalu) mediante la eliminación de la inhibición dopaminérgica. Comp. general. Endocrinol. 142, 212–221 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Lubzens, E., Young, G., Bobe, J. & Cerdà, J. Oogénesis en teleósteos: cómo se forman los huevos de peces. Comp. general. Endocrinol. 165, 367–389 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Greeley, M., Calder, D. y Wallace, R. Crecimiento y desarrollo de ovocitos en el salmonete despojado, Mugil cephalus, durante el recrudecimiento ovárico estacional: relación con la fecundidad, el tamaño y la madurez. Pez. Toro. 85, 187 (1987).

Google Académico

Schulz, RW y cols. Espermatogénesis en peces. Comp. general. Endocrinol. 165, 390–411 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Giménez, G. et al. Criterios de calidad del huevo en dentón común (Dentex dentex). Acuicultura 260, 232–243 (2006).

Artículo de Google Scholar

Divanach, P. & Kentouri, M. Técnicas de incubación para la diversificación específica en larvicultura de peces del Mediterráneo. En Diversificación de especies de peces de aleta de acuicultura marina del Mediterráneo, vol. 47 (ed. Basurco, B.) 75–87 (Cahiers Options Méditerranéennes, CIHEAM, 2000).

Google Académico

Hagiwara, A., Oozeki, Y., Eda, H. y Lee, C.-S. Cambios en el desarrollo de la selectividad alimentaria del salmonete Mugil cephalus durante la etapa larvaria. Diario japonés 58, 1381 (1992).

Artículo de Google Scholar

Valdebenito, I., Paiva, L. & Berland, M. Atresia folicular en peces teleósteos: Una revisión. Arch. Med. Vet. 43, 11–25 (2011).

Artículo CAS Google Scholar

González-López, W. Á., Ramos-Judez, S., Giménez, I. y Duncan, Nueva Jersey Contaminación de esperma por orina en soja senegalesa (Solea senegalensis) y uso de soluciones diluyentes para almacenamiento refrigerado a corto plazo. Acuicultura 516, 734649 (2020).

Artículo de Google Scholar

Kumar, P. y col. Desarrollo gonadal y perfil de hormonas esteroides en salmonetes silvestres (Mugil cephalus). Biol. Res. Ritmo. 46, 601–610 (2015).

Artículo CAS Google Scholar

Kobayashi, M. y col. Producción de gonadotropinas de anguila japonesa recombinantes por baculovirus en larvas de gusanos de seda. Comp. general. Endocrinol. 167, 379–386 (2010).

Artículo CAS PubMed Google Scholar

Kamei, H., Kaneko, T. y Aida, K. Efectos gonadotrópicos in vivo de la hormona estimulante del folículo de anguila japonesa recombinante. Acuicultura 261, 771–775 (2006).

Artículo CAS Google Scholar

Hayakawa, Y. et al. Actividades biológicas de la hormona estimulante del folículo y la hormona luteinizante del pez dorado de cadena sencilla. Acuicultura 274, 408–415 (2008).

Artículo CAS Google Scholar

Chauvigné, F. et al. La hormona folículo estimulante y la hormona luteinizante median la vía androgénica en las células de Leydig de un teleósteo evolutivamente avanzado1. Biol. Reproducción. 87, 1. https://doi.org/10.1095/biolreprod.112.100784 (2012).

Artículo CAS Google Scholar

Ramachandran, B. & Natesan, M. Evaluación de la calidad del esperma y conservación a corto plazo del esperma en salmonete Mugil cephalus Linnaeus, 1758. Indian J. Fish. https://doi.org/10.21077/ijf.2016.63.4.61001-23 (2016).

Artículo de Google Scholar

Schulz, RW & Miura, T. La espermatogénesis y su regulación endocrina. Fisiol de pescado. Bioquímica. 26, 43–56 (2002).

Artículo CAS Google Scholar

El-Gharabawy, M. & Assem, S. Inducción del desove en el salmonete gris mediterráneo Mugil cephalus y etapas de desarrollo larvario. African J. Biotecnología. 5, 1836–1845 (2006).

Google Académico

Besbes, R. y col. Producción de alevines de salmonetes de labios gruesos (Chelon labrosus) y cabeza plana (Mugil cephalus) en la acuicultura tunecina. Aquac. Reps. Rev.17, 100380 (2020).

Artículo de Google Scholar

Vallainc, D. y col. Producción de salmonetes de cabeza plana Mugil cephalus (Linnaeus, 1758) alevines en cautiverio a partir de adultos sexualmente maduros recolectados en lagunas sardas. Aquac. Rep. 21, 100844. https://doi.org/10.1016/j.aqrep.2021.100844 (2021).

Artículo de Google Scholar

Mathew Abraham, PS, Chandra, PK, Kailasam, M. & Charles, V. Desarrollo embrionario y larvario del salmonete rayado Mugil cephalus (L.). Indio J. Pescado. 2, 123-131 (1999).

Google Académico

Loi, B., Papadakis, IE, Leggieri, F., Gimenez Papiol, G. & Vallainc, D. Ontogenia del sistema digestivo y ojo del salmonete de cabeza plana criado, Mugil cephalus (Linnaeus, 1758), y evaluación de la deposición de lípidos en el hígado según el protocolo de alimentación. Acuicultura 526, 735386 (2020).

Artículo CAS Google Scholar

Tamaru, CS, Murashige, R. y Lee, C.-S. La paradoja de utilizar fitoplancton de fondo durante el cultivo de larvas de salmonete rayado, Mugil cephalus L.. Aquaculture 119, 167-174 (1994).

Artículo de Google Scholar

Ignatius, B., Joseph, I. & Muktha, M. Mugil cephalus Linnaeus, 1758. En Especies priorizadas para la maricultura en la India (eds Ranjan, R., Muktha, M., Ghosh, S., Gopalakrishnan, A., Gopakumar , G. et al.) 237–244 (ICAR-CMFRI, 2017).

Google Académico

Maslova, ON Dinámica de la composición química del salmonete Mugil cephalus del Mar Negro en el período de ontogénesis temprana y su dependencia de la temperatura y la salinidad. J. Ictiol. 51, 382–391 (2011).

Artículo de Google Scholar

Nash, CE, Kuo, C.-M., Madden, WD y Paulsen, CL Inflación de la vejiga natatoria y supervivencia del cerebro de Mugil hasta 50 días. Acuicultura 12, 89–94. https://doi.org/10.1016/0044-8486(77)90049-7 (1977).

Artículo de Google Scholar

Nash, CE y Kuo, C.-M. Hipótesis sobre los problemas que impiden la propagación masiva del salmonete y otros peces. Acuicultura 5, 119–33. https://doi.org/10.1016/0044-8486(75)90093-9 (1975).

Artículo de Google Scholar

Vallés, R. & Estévez, A. Condiciones lumínicas para la cría larvaria de corvina (Argyrosomus regius). Acuicultura 376–379, 15–19.

Artículo de Google Scholar

Villamizar, N. et al. Efectos de la luz durante el desarrollo larvario temprano de algunos teleósteos acuícolas: una revisión. Acuicultura 315, 86–94 (2011).

Artículo de Google Scholar

Roo, J., Hernandez-Cruz, M., Borrero, C., Schuchardt, D. & Fernandez-Palacios, H. Efecto de la densidad larval y la secuencia de alimentación en la cría de larvas de corvina (Argyrosomus regius; Asso, 1801). Acuicultura 302, 82–88.

Artículo de Google Scholar

Grotmol, S., Kryvi, H. & Totland, GK La deformación de la notocorda por la presión de la vejiga natatoria puede causar una malformación de la columna vertebral en larvas cultivadas de bacalao del Atlántico Gadus morhua: un estudio de caso. Dis. Agua. Organo. 65, 121-128 (2005).

Artículo PubMed Google Scholar

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Un agradecimiento especial a Cristian Martínez Rodríguez, Alex Rullo Reverté, Esteban Hernández, Magda Monllaó y Sandra Molas por el cuidado de los peces y larvas y la ayuda técnica en los muestreos. Gracias también a Marta Sastre, Edgar Bertomeu y Noelia Gras por la ayuda en el análisis de esteroides. Este estudio fue financiado por el Gobierno de España, MINECO, proyecto: RTI2018-094710-R-I00.

Sandra Ramos-Júdez

Dirección actual: S2AQUAcoLAB, Av. Do Parque Natural da Ria Formosa s/n, 8700-194, Olhão, Portugal

IRTA, San Carlos de la Rápita, Ctra. de Pueblo Nuevo km. 5.5, 43540, San Carlos de la Rápita, Tarragona, Spain

Sandra Ramos-Júdez, José Gumbau-Pous, Lucas Stephen Arnold-Cruañes, Alicia Estévez & Neil Duncan

Rara Avis Biotec, S. L., Valencia, Spain

Ignacio Giménez

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SR-J.: Conceptualización, Metodología, Investigación, Análisis formal, Escritura-Preparación del borrador original, Visualización. IG: Conceptualización, Metodología, Escritura-Revisión y Edición, Supervisión. JG-P.: Investigación, Escritura-Revisión y Edición. LSA-C.: Investigación, Escritura-Revisión y Edición. AE: Metodología, Investigación, Análisis formal, Escritura-Revisión y Edición, Visualización, Adquisición de financiación. ND: Conceptualización, Metodología, Investigación, Curación de datos, Escritura-Revisión y Edición, Supervisión, Adquisición de fondos, Administración de proyectos.

Correspondence to Sandra Ramos-Júdez, Ignacio Giménez or Neil Duncan.

El Dr. IG está asociado con la empresa biotecnológica Rara Avis Biotec, SL, que produjo las gonadotropinas recombinantes empleadas en este estudio. Aparte de esto, no hay patentes ni productos en desarrollo que declarar. El resto de los autores contribuyentes no declaran intereses en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Ramos-Júdez, S., Giménez, I., Gumbau-Pous, J. et al. Terapia recombinante con Fsh y Lh para la inducción del desove de teleósteos detenidos previtelogénicos y espermatogénicos tempranos, el salmonete de cabeza plana (Mugil cephalus). Representante científico 12, 6563 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-10371-0

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Recibido: 30 de noviembre de 2021

Aceptado: 28 de marzo de 2022

Publicado: 21 de abril de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-10371-0

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